Se activa un control fotosintético PSII en cultivos anóxicos de algas verdes después de la iluminación

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 514 (2023) Citar este artículo

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Se considera que la producción de hidrógeno fotosintético a partir de microalgas tiene potencial como fuente de energía renovable. Sin embargo, el proceso tiene dos limitaciones principales que impiden que se amplíe; (i) pérdida de electrones por procesos competitivos, principalmente fijación de carbono y (ii) sensibilidad al O2 que disminuye la expresión y la actividad de la enzima hidrogenasa que cataliza la producción de H2. Aquí informamos un tercer desafío, hasta ahora desconocido: descubrimos que bajo anoxia, se activa un interruptor de desaceleración en el fotosistema II (PSII), lo que disminuye la productividad fotosintética máxima en tres veces. Usando PSII purificado y aplicando técnicas de espectrometría de masas y espectroscópica in vivo en cultivos de Chlamydomonas reinhardtii, mostramos que este interruptor se activa bajo anoxia, dentro de los 10 s de iluminación. Además, mostramos que la recuperación a la velocidad inicial tiene lugar después de 15 min de anoxia oscura y proponemos un mecanismo en el que la modulación en la transferencia de electrones en el sitio aceptor de PSII disminuye su salida. Estos conocimientos sobre el mecanismo amplían nuestra comprensión de la fotosíntesis anóxica y su regulación en las algas verdes e inspiran nuevas estrategias para mejorar los rendimientos de bioenergía.

El flujo de electrones fotosintéticos es crucial para el desarrollo de la vida compleja en la tierra, ya que en este proceso, la luz solar es capturada como fuente de energía primaria para la mayoría de los organismos vivos. Este proceso es conocido principalmente por su papel en la evolución de O2 por el fotosistema II (PSII) de cianobacterias, algas y plantas1,2. Sin embargo, la recolección de la luz solar, aunque es muy eficiente como fuente de energía primaria, no está exenta de desafíos. Uno de los principales problemas que enfrentan las plantas es la inestabilidad e inconsistencia de los niveles de irradiación. Para superar estos problemas, las plantas han desarrollado una sofisticada red de procesos reguladores que ajustan la eficiencia del aparato fotosintético. El proceso de flujo de electrones se regula constantemente para sortear las barreras de acuerdo con la disponibilidad de metabolitos del aparato fotosintético. Se postuló que tanto el equilibrio redox como la sublocalización de complejos en la membrana tilacoidal plantean un "control fotosintético" y mantienen el flujo de electrones para adaptarse a la capacidad del sistema3,4. Las microalgas verdes, que están continuamente sujetas a cambios ambientales, también han desarrollado varios mecanismos reguladores para hacer frente a los rápidos cambios en la calidad e intensidad de la luz5. Estos procesos permiten a las células hacer frente a transiciones rápidas desde la oscuridad a medida que aumentan la cantidad de productos aguas abajo disponibles de ambos fotosistemas y, por lo tanto, alivian las limitaciones del lado del aceptor. Sin embargo, cuando tal transición se lleva a cabo bajo anaerobiosis, debido a la respiración de las células o al barrido externo de O2, la evolución de H2 por hidrogenasa, que de otro modo es propensa a la inactivación por O26, se convierte en la única válvula efectiva para hacer frente a un exceso de energía sobre tales exposiciones súbitas a la luz7,8,9.

La producción de H2 a partir de algas verdes atrae mucha investigación, ya que se considera una fuente potencial de energía renovable. Recientemente, se logró un posible avance hacia su escalabilidad, ya que se demostró una producción prolongada de H2 ambiental10,11. En consecuencia, se demostró que los dos desafíos principales que han estado frenando la producción escalable de H2 a partir de algas verdes (inactivación por daño de O2 y competencia con la fijación de CO212,13) se pueden resolver. De hecho, se demostró anteriormente que desafiar las células con luz fluctuante, que varía de minutos o menos, puede limitar el O2 a niveles bajos y, por lo tanto, mejorar la sostenibilidad de la producción de H27,14,15. Sin embargo, tales intentos resolvieron otra barrera, aún no identificada, para la evolución de H2. Se demostró que la exposición inicial a la luz, luego de la incubación anaeróbica en la oscuridad, desencadena un flujo rápido de electrones, según lo informado por las altas tasas de evolución de H2. Por el contrario, las exposiciones sucesivas dan como resultado una disminución de 3 veces en la acumulación de H2, independientemente del número de ciclos de luz oscura7. Hasta la fecha, el mecanismo responsable de este dramático declive sigue siendo esquivo. En este trabajo, exploramos los orígenes de esta disminución masiva a través de las evaluaciones de los flujos de electrones globales y locales en cultivos de algas intactas y complejos PSII purificados. Registramos e integramos los procesos de transporte de electrones desde el centro de evolución de oxígeno (OEC) en PSII hasta los procesos aguas abajo de PSI. Nuestros resultados sugieren que el "control fotosintético" activado por redox, que es responsable de una desaceleración en la actividad de Cytb6f, genera limitaciones de aceptación en PSII, lo que altera su mecanismo de flujo de electrones interno y causa una reducción masiva en la salida efectiva de electrones. Esta regulación a la baja, que posiblemente involucra la fotorreducción de O2 en el sitio aceptor de PSII y posiblemente una conformación alternativa de la disposición de los residuos del sitio aceptor, se traduce más tarde en una disminución notable en la producción de H2.

Los cultivos anóxicos oscuros de microalgas verdes emiten inmediatamente H2 a altas tasas tras la exposición a la luz. Para examinar su cinética, se cultivaron células de C. reinhardtii en medio mixotrófico y se incubaron en anoxia oscura durante una hora. Como se describió previamente7, después de la incubación, expusimos las células a la luz (370 µE m−² s−¹) durante 2 min, y las concentraciones de H2 y O2 evolucionadas se monitorearon usando un espectrómetro de masas de entrada de membrana (MIMS)16 (Fig. .1a, b). Como era de esperar, después de un estallido inicial, la tasa de evolución de H2 disminuyó rápidamente hasta un cese completo. Cuando la acumulación de H2 se estabilizó, se apagó la luz. Es importante destacar que el seguimiento de la acumulación de O2 nos permitió mantener las células en la oscuridad durante el tiempo suficiente para respirar O2 por completo (3-5 min), por lo tanto, mantener la anoxia. A continuación, volvimos a iluminar las células durante 2 min y observamos que se reanudaba la evolución de H2. Estas fluctuaciones de luz/oscuridad (ciclos) se repitieron cuatro veces, y aunque se desarrolló H2 en todas las exposiciones sucesivas a la luz, observamos una disminución global de ~3 veces en las tasas de acumulación de H2 en comparación con la primera exposición a la luz (Fig. 1a— punteado vs sólido). Curiosamente, también observamos que la exposición inicial desencadenó un aumento lineal inmediato en la evolución neta de O2, en contraste con las exposiciones sucesivas en las que se puede ver un aumento exponencial (Fig. 1b: discontinua frente a sólida). Para evaluar si estas diferencias se limitan solo al crecimiento mixotrófico, realizamos una prueba similar, utilizando células que se cultivaron en condiciones autótrofas (Figura 1 complementaria). En particular, las tasas de producción de H2 fueron más bajas en los cultivos fotoautotróficos, como informamos anteriormente7. Dado que estas condiciones estimulan tasas más altas de evolución de O2, el O2 acumulado aumenta la inhibición competitiva de la actividad hidrogenasa (mediante reacciones como la 'similar a Mehler', Mehler y otras17). Por lo tanto, realizamos estas mediciones en presencia o ausencia de secuestrantes de O2 (glucosa oxidasa [GOx], suministrada con glucosa y catalasa). La adición de tales carroñeros aumentó ligeramente la cantidad de H2 acumulado, de 10,7 ± 1,7 µM H2 en su ausencia a 14,4 ± 1,3 µM H2 en su presencia (aproximadamente la mitad del valor acumulado bajo células adaptadas mixotróficas, 32,6 ± 2,5 µM H2 ). Además, como se observó para las condiciones mixotróficas, observamos una marcada disminución en las tasas de producción de H2, entre la primera y las sucesivas exposiciones a la luz (para ambos tratamientos), que se situó en 50 ± 1% y 65 ± 6% de inhibición, en ausencia o presencia de secuestrantes de O2, respectivamente.

Se incubaron cultivos mixotróficos de C. reinhardtii de tipo salvaje (cepa CC124) durante una hora en anaerobiosis oscura, después de lo cual se desafiaron con fluctuaciones de luz de 2 min bajo iluminación (a una irradiación de 370 µmol fotones m−² s−¹, blanco fondo), seguido de 3 min de oscuridad (fondo gris). Se muestran las diferencias entre la exposición a la luz inicial (discontinua) y el promedio de las exposiciones sucesivas (continua). Las concentraciones de H2 (a) y O2 (b) se midieron usando MIMS, y la fluorescencia de Chl a se midió simultáneamente usando PAM (c). Durante las iluminaciones, las células se expusieron a pulsos de saturación (marcados con una flecha roja) para evaluar la intensidad de fluorescencia máxima. Se usó el mismo protocolo para evaluar los cambios en los cambios electrocrómicos (a 520–546 nm) mediante un JTS (d), para lo cual las células se expusieron a un destello láser de 30 s antes de cada exposición a la luz (ver flechas negras en el panel a). ). Los gráficos de la derecha en cada panel muestran una comparación entre la exposición inicial (discontinua) y el promedio de las tres exposiciones sucesivas (continuas), en relación con su estado al inicio de la luz o el destello del láser (tiempo, 0). Cada curva representa el resultado promedio de al menos 3 repeticiones biológicas.

Las mediciones de O2 neto no son suficientes para estimar correctamente la eficacia del PSII porque solo pueden reflejar su producción bruta en algún nivel. Por lo tanto, también probamos alteraciones en la eficacia fotosintética midiendo la clorofila (Chl) a fluorescencia18,19 (Fig. 1c). La cinética de la fluorescencia de Chl a, después de la anoxia oscura, presenta dos picos20. El primer pico se alcanza inmediatamente después de la exposición a la luz, ya que todos los sitios QB están ocupados con plastoquinol21. El segundo pico se alcanza varios segundos después debido a cualquiera de los dos; (i) la activación de procesos posteriores, específicamente la fijación de CO2 por el ciclo CBB22, (ii) cambios conformacionales en PSII19,23, o (iii) distribución de complejos de antena LHCII (transición de estado)24. Después de estos picos, la señal de fluorescencia alcanza un estado estable. Como era de esperar, observamos que en la exposición inicial a la luz, la señal aumentó durante 30 s (discontinua en la Fig. 1c)25. Por el contrario, las iluminaciones sucesivas desencadenaron un aumento brusco inmediato, en el marco de tiempo del primer pico de la exposición inicial y no presentaron ningún pico adicional. Cabe señalar, sin embargo, que después de 60 s de iluminación, todos los rastros de fluorescencia se igualaron y disminuyeron constantemente de la misma manera. Para evaluar si se alteró la disipación de calor o la transición de estado, expusimos las células a un pulso de saturación, ya que las trazas alcanzaron el estado estable (ver flechas rojas en la Fig. 1c) y determinamos la fluorescencia máxima (Fm '). No observamos cambios significativos entre las exposiciones a la luz (Figura 2 complementaria), lo que indica cambios mínimos, si los hubiere, en la magnitud de la extinción no fotoquímica, ni una disminución de la eficiencia del PSII debido a la transición de estado a medida que las células alcanzan el estado estacionario. Para verificar que, de hecho, no se produjeron cambios en la ubicación de las antenas LHCII, tomamos muestras de células directamente de la cubeta del experimento y examinamos sus espectros de fluorescencia a 77 °K (Figura 3 complementaria). Observamos que los picos, que se observan a ~680 nm y ~710 nm, no presentan alteraciones entre el primer pulso de luz y los consecutivos, lo que indica que el tiempo de exposición a la luz (2 min) no es suficiente para generar la transición de estado26, en de acuerdo con investigaciones previas9.

Para verificar que los cambios no se originen por alteraciones en la eficiencia general de los fotosistemas, examinamos las diferencias en los cambios electrocrómicos (ECS) entre las exposiciones a la luz, rastreando los cambios en la absorbancia a 520 y 546 nm27 (Fig. 1d, ver también; negro flechas en la Fig. 1a). Cuando las células se exponen a un único destello láser de rotación, su absorbancia cambia a través de un cambio de 3 fases27. El aumento inicial en la señal ECS (denominada "fase a") dura menos de un milisegundo y es producto de las separaciones de carga que tienen lugar en ambos fotosistemas, por lo que la disminución de la señal puede informar sobre la disminución de la actividad de PSII y PSI. Durante la segunda fase (denominada "fase b"), que suele durar hasta 10 ms28, la señal de ECS aumenta debido a una acumulación de potencial de membrana, principalmente a través de Cytb6f. En la fase final (denominada "fase c"), la señal disminuye exponencialmente debido a la disipación del potencial de membrana a través de la actividad ATPasa. Aquí observamos que todos los destellos, que se dieron antes de cada exposición a la luz (ver flechas negras en la Fig. 1a), desencadenaron un cambio idéntico, lo que indica que el estado redox al inicio de la luz fue similar entre las fluctuaciones de luz (Fig. 1d).

Anteriormente se demostró que la activación del flujo de electrones cíclicos de PSI, mediante la exposición continua a la luz, aumenta la fuerza motriz del protón a través de la membrana tilacoide, lo que inicia el "control fotosintético"29 y, por lo tanto, provoca un cambio en los pasos limitantes de la velocidad del aparato fotosintético. . El control fotosintético se activa por el equilibrio redox elevado, que depende de la duración de la irradiación. Dicha regulación se propuso para disminuir el flujo lineal de electrones3 y, posteriormente, disminuir la producción de H230. Por lo tanto, se podría sugerir que tales cambios en el flujo de electrones deberían requerir un tiempo suficiente para que se desarrolle el equilibrio redox a través de la membrana tilacoide. Para probar esta hipótesis, después de una hora de incubación en oscuridad, expusimos los cultivos a la luz, durante un tiempo variable, entre 5 y 180 s (Fig. 2a). Luego, las células se mantuvieron en oscuridad durante 3 min, antes de exponerlas a la luz por segunda vez, durante 2 min más. Se realizaron dos fluctuaciones más (de 3 min de oscuridad/2 min de iluminación, marcadas como exposiciones III y IV) para verificar que efectivamente no ocurren más cambios durante el experimento. Luego rastreamos la evolución de H2 (Fig. 2b) y la cinética lenta de la fluorescencia de Chl a (Fig. 2c) durante la segunda iluminación de 2 min (ver el cuadrado en la Fig. 2a) y trazamos los resultados de acuerdo con la duración anterior de la exposición inicial (es decir, exposición I). Nuestros resultados muestran que la activación del mecanismo de regulación fotosintética aumenta gradualmente durante los primeros 30 s de iluminación (de acuerdo con nuestra observación en la Fig. 1b).

Se analizó la evolución de H2 en un MIMS en células mixotróficas de C. reinhardtii de la cepa de tipo salvaje CC124. Las células se incubaron durante una hora en anaerobiosis oscura, después de lo cual se iluminaron (370 µE m−² s−¹) durante 5, 10, 20, 30, 45, 60, 120 o 180 s (Exposición I, ver escala de tiempo atornillada). Aquí se presenta la traza, que se midió exponiendo las células durante 45 s en la exposición I. Después de la exposición inicial a la luz, las células se mantuvieron en la oscuridad durante 3 min (fondo gris) y se iluminaron de nuevo durante 2 min. tres veces (Exposiciones II, III y IV, fondo blanco). Para comparar los efectos de la duración de la exposición I en la regulación fotosintética, los resultados que se midieron durante la exposición II se representaron frente a la concentración acumulada de H2 (b) y la eficiencia fotosintética, que se evaluó mediante mediciones de fluorescencia de Chl a (c). Los cambios electrocrómicos se determinaron midiendo los cambios en la absorbancia de las células (520–546 nm). Tres segundos después de la exposición I (ver la flecha discontinua en el panel a), las células se expusieron a un destello láser de 5 ns y se midió la separación de carga (d). El índice de color en todos los paneles coincide con la duración de la exposición I (rango de segundos): 5: violeta, 10: azul, 20: cian, 30: verde, 45: verde claro, 60: amarillo, 120: rojo y 180: oscuro rojo. Cada experimento se repitió utilizando al menos tres réplicas biológicas. Las barras de error indican el error estándar (n ≥ 3).

Para obtener una mejor comprensión de la activación del "control fotosintético", monitoreamos la acumulación de equilibrio redox, que está asociado con él. Expusimos las células a un destello láser corto 3 s después de la exposición inicial a la luz (ver flecha negra en la Fig. 2a) y medimos los cambios en la cinética de acumulación de ECS (Fig. 2d). Observamos que, aunque no hay diferencias aparentes en la separación rápida de carga en la "fase a" (Figura 4 complementaria), la acumulación del potencial redox, visto por la falta de un aumento aparente en la traza en la "fase b", es gradual lo que está de acuerdo con la disminución de la producción de H2. Dichos cambios en el potencial redox también deberían disminuir el flujo de electrones a través de Cytb6f, debido a la activación del "control fotosintético", y por lo tanto plantean gradualmente una limitación del lado del donante en el PSI y una limitación del lado del aceptor en el PSII. En última instancia, dicha limitación podría resultar en una disminución de la tasa de flujo de electrones lineales, que también se ve como una tasa más baja de producción de H2. Por supuesto, es posible que una actividad amplificada de la ATPasa, que se observa como una disminución acelerada en la "fase c", disminuya la acumulación de carga membranal y, por lo tanto, disminuya la amplitud observada en la "fase b"31. Sin embargo, esto debería indicar nuevamente una formación rápida de equilibrio redox, ya que es necesario para inducir tal actividad acelerada de ATPasa y, por lo tanto, también debería dar como resultado la generación de "control fotosintético" que formaría limitaciones aceptoras en PSII. Estos resultados están en línea con la noción de que bajo anoxia, el equilibrio redox formado disminuye la velocidad del flujo de electrones lineales. Sin embargo, aquí sugerimos que estos rasgos generan una limitación más grave, que se sitúa dentro del PSII, por una alteración de su mecanismo de funcionamiento.

Con el fin de precisar la causa de la aparente disminución en el flujo de electrones lineales, evaluamos el efecto de la anoxia en la actividad del PSII aislado. Con ese objetivo, purificamos los complejos PSII de las células CC124 de la cepa de tipo salvaje de C. reinhardtii y examinamos las tasas de evolución de O2, utilizando una sonda Pyroscience FireSting O2 probe32 (Fig. 3a). Expusimos complejos de PSII purificados a luz actínica en presencia de 2,5-dicloro-p-benzoquinona (DCBQ) para que no enfrentaran limitaciones del lado del aceptor en el sitio QB. Los complejos se expusieron a 10 s de iluminación, en los que se determinaron las tasas de evolución de O2, antes de apagar la luz durante un minuto. Luego, las expusimos por otros 10 s de iluminación y determinamos la actividad residual de la 2da exposición, en relación con la 1ra. Dado que examinamos los efectos de la anoxia en la actividad de PSII, realizamos el experimento en condiciones aeróbicas o anóxicas, que se establecieron lavando las muestras con N2 (Fig. 3a, aeróbico frente a anoxia, respectivamente). Además, para evaluar los efectos del bicarbonato (que se agregó en forma de NaHCO3, consulte "Métodos"), realizamos el mismo experimento en su presencia o ausencia total. Los resultados muestran que las condiciones anóxicas oscuras disminuyen gravemente la actividad del PSII hasta en un 70 %, tras las exposiciones iniciales a la luz, en consonancia con las observaciones anteriores33. Los resultados también muestran que la exposición inicial a la luz no se vio afectada por la presencia o ausencia de NaHCO3 (ni en condiciones aeróbicas ni anóxicas). Cabe señalar que el rociado de N2 redujo la concentración de bicarbonato de 10 mM a 7,5 mM según lo medido por MIMS (Figura 5 complementaria). Curiosamente, observamos que en la segunda iluminación, las tasas de evolución de O2 no se vieron afectadas en condiciones aeróbicas, ni en presencia o ausencia de NaHCO3. Sin embargo, las condiciones anóxicas desencadenaron una disminución de la actividad de ~45 % en la segunda iluminación (con un significado de pv = 0,0154 en la prueba t de Student), solo en presencia de NaHCO3.

Los complejos PSII se aislaron de células CC124 de la cepa de tipo salvaje de C. reinhardtii, y su actividad se probó con una sonda Pyroscience FireSting O2, (a). Los complejos se probaron en ausencia o presencia de NaHCO3 10 mM (real 7,5 mM) para imitar las condiciones de alto contenido de carbono y se examinaron en condiciones aeróbicas o anóxicas. Los complejos se expusieron dos veces durante 10 s de luz, con un período de oscuridad de un minuto en el medio. Se muestran las tasas de las exposiciones 1 (azul) y 2 (blanco), para cada conjunto de condiciones. También se indican las tasas de actividad residual entre cada exposición alineada (según tasa media). Los complejos en presencia de NaHCO3 también se probaron durante períodos aumentados de iluminación de 5, 10, 20 o 30 s (púrpura, azul, cian y verde, respectivamente), en condiciones aeróbicas (rayas) o anóxicas (sólidas) en la presencia de NaHCO3 10 mM (real 7,5 mM) (b). Se presenta la tasa residual de O2, que se acumuló en la segunda exposición, en comparación con la iluminación inicial. La siguiente tabla presenta las tasas de la primera y la segunda exposición para cada tratamiento (µmol O2 mg Chl−1 h−1), así como el número de repeticiones para cada resultado. Además, la diferencia entre los tratamientos aeróbico y anóxico se analizó mediante una prueba t de Student. Los valores de p se indican para cada pareja. Cada experimento se repitió utilizando al menos tres réplicas biológicas. Los datos se presentan en diagramas de caja.

En nuestros exámenes in vivo, observamos que la inhibición de la actividad aparente del PSII aumenta con exposiciones prolongadas a la luz (Fig. 2). Para probar estos efectos en complejos PSII aislados, los iluminamos con duraciones de 5, 10, 20 o 30 s (Fig. 3b, púrpura, azul, cian y verde respectivamente, la coloración coincide con otros paneles). Como antes, los complejos se expusieron a dos iluminaciones, se determinó la tasa de evolución de O2 para cada exposición y se calculó la relación de actividad residual para cada duración de la exposición. Sorprendentemente, en condiciones aeróbicas, no se observó una disminución en la actividad del PSII a lo largo de las exposiciones y una actividad sostenida de ~85 % (Fig. 3b, columnas rayadas). Por el contrario, los complejos que fueron expuestos a la luz bajo anoxia en presencia de bicarbonato, presentaron una disminución gradual en su actividad concomitante con mayores tiempos de exposición, y se determinó que desarrollaron un 63% menos de O2 durante 30 s de iluminaciones, lo cual está en en línea con nuestras observaciones in vivo.

Dado que observamos que la exposición a la luz provocó una disminución en el flujo de electrones lineales, examinamos si tales modulaciones son permanentes o podrían revertirse mediante una oscuridad anóxica prolongada. Con ese objetivo, aumentamos gradualmente la duración de la oscuridad entre las exposiciones a la luz, que se establecieron en una iluminación constante de 2 minutos (Fig. 4a). Los períodos de recuperación de la oscuridad se programaron en 3, 5, 7, 10 y 15 min, con 3 min adicionales de oscuridad antes de la última iluminación para verificar que las alteraciones observadas se deben realmente a la duración de la oscuridad, en lugar del tiempo total que aprobado en el experimento (marcado con un asterisco; 3*). Además, para eliminar posibles interferencias por O2 acumulado, añadimos un secuestrante de O2, glucosa oxidasa (GOx, abastecido con glucosa y catalasa34). Los resultados muestran que la disminución en la evolución de H2, después de 3 min de oscuridad, no se ve afectada por la ausencia de O2 (Fig. 4b), y que la tasa de evolución de H2 aumenta en función del tiempo de recuperación de la oscuridad. También observamos que las células requieren al menos 15 minutos de oscuridad para recuperar completamente la tasa de evolución inicial de H2. Dado que anteriormente observamos alteraciones en la actividad de PSII (Fig. 1c), rastreamos los cambios en la fluorescencia de Chl a (Fig. 4c) simultáneamente con las mediciones de MIMS. Aquí, observamos los mismos cambios graduales en el aumento temprano de la fluorescencia de ~ 60 s, lo que indica que la actividad de PSII se recuperó en el período de oscuridad de 15 min. Para verificar que la transición de estado no redujo la intensidad de la fluorescencia, expusimos las células a un pulso de saturación 60 s antes y 30 s después de cada período de iluminación y no observamos diferencias entre los valores máximos de fluorescencia emparejados (Figura 6 complementaria). Por lo tanto, podríamos concluir que la actividad potencial de PSII no disminuye debido al fotodaño o las transiciones de estado.

Después de una hora de incubación en la oscuridad en presencia de captadores de O2 (GOx), las células CC124 de la cepa de tipo salvaje de C. reinhardtii se sometieron a una serie de exposiciones de luz de duración fija (370 µE m−2 s−1 durante 2 min, blanco fondo) nacieron con una duración creciente de incubaciones oscuras anóxicas de 0 a 15 min. una acumulación de H2 en función del tiempo de incubación oscuro precedido (fondo gris) entre 2 min fijos de irradiancia. MIMS midió la producción de H2 en cada exposición a la luz y la traza se resalta de acuerdo con la duración anterior de la incubación en la oscuridad (exposición inicial, 0: línea discontinua, 3 min: púrpura, 5 min: azul, 7 min: verde, 10 min —amarillo, 15 min—rojo, 3 min adicionales—rosado punteado, se usó el mismo índice de color para todas las trazas en todos los paneles). b Para ayudar a la comparación entre las diferencias en los rastros de acumulación de H2 que se muestran en el panel a, todos los rastros medidos en cada período de luz se trazan a la vez usando un solo marco de tiempo fijo. c Para evaluar los cambios en la eficiencia fotosintética del PSII, se midió simultáneamente la fluorescencia de Chl a. Durante cada iluminación, las células se expusieron a un pulso de saturación y se determinó la fluorescencia máxima (Fm'). La eficiencia fotosintética luego se normalizó a Fm'. d La termoluminiscencia de las células de algas intactas se midió después de 2 destellos de rotación únicos (STF) separados por 1 s. Las muestras se midieron después de una hora de incubación anaeróbica oscura (gris). Luego, se iluminaron durante 2 min seguidos de una relajación oscura de 5 (azul) o 15 (rojo) minutos y la temperatura en la que se detectaron los valores máximos para la banda B. Los valores obtenidos se representaron en diagramas de caja. Cada experimento se repitió utilizando al menos tres réplicas biológicas.

Luego examinamos las alteraciones en el transporte de electrones dentro de PSII, evaluando el efecto de la exposición a la luz en células intactas por termoluminiscencia (TL). La emisión de luz de una muestra preiluminada durante el aumento de la temperatura proporciona información valiosa sobre las reacciones de recombinación de carga que ocurren dentro del PSII (para revisiones sobre el tema, consulte las refs. 35,36). Cuando las células u hojas intactas se exponen a dos destellos de recambio únicos, la "banda B" aparece con un máximo alrededor de 20 a 40 °C, originada por una recombinación mixta de QB- con los estados S2 y S3 del OEC35. Medimos las células intactas después de una hora de incubación anóxica oscura y observamos la intensidad máxima de la banda B a 18,1 ± 1,5 °C (Fig. 4d, los rastros sin procesar y los efectos de los destellos adicionales en la banda B se presentan en la (Figura 7 complementaria) )). Luego expusimos las células a 2 minutos de luz, seguidos de 5 minutos de oscuridad y realizamos una medición de TL después de dos destellos. Unos pocos minutos de adaptación a la oscuridad suelen ser suficientes para una recuperación completa de la banda B; sin embargo, en los cultivos anóxicos iluminados durante 2 min se observó una disminución importante en la intensidad de la banda B, lo que indica que se produjo una menor recombinación de carga entre los estados S2 y S3 del OEC y QB- o, alternativamente, la recombinación se produjo a través de la radiación no radiativa. vías37,38. Además, la posición del pico de la intensidad máxima de TL se redujo significativamente, a 12,3 ± 1,0 °C (con un valor de p de 0,005 en una prueba t de Student). Estos cambios indican que el equilibrio redox entre QA- y QB- cambió hacia QA-, facilitando la recombinación de carga entre QA- con el lado donante. Para evaluar si estos cambios se invierten durante períodos más largos de oscuridad anóxica, expusimos las células a un segundo período de iluminación de 2 minutos seguido de 15 minutos de oscuridad anóxica. Observamos que tanto la intensidad como la posición máxima de la banda B (18,4 ± 1,7 °C) se recuperaron en gran medida después de 15 min de anoxia oscura. Estos hallazgos indican que las reacciones de recombinación de carga dentro del PSII se alteran por la exposición a la luz de manera reversible. Los datos también sugieren que la causa de la aparente disminución en la salida del flujo total de electrones bajo anaerobiosis puede explicarse por los cambios que ocurren dentro del PSII.

En la naturaleza, las algas verdes están sujetas a diversos cambios ambientales. Dado que dependen principalmente del funcionamiento del aparato fotosintético, muchos de estos cambios se resuelven mediante la capacidad de las células para alternar rápidamente el curso de su flujo metabólico de electrones39,40. De hecho, la activación o desactivación de los sumideros de electrones ha sido el tema de muchas investigaciones recientemente y se demostró que tiene un papel crucial en la capacidad de las células para mantener la funcionalidad5,7,8,15. En este trabajo, demostramos que las algas verdes bajo anoxia tienen mecanismos de regulación adicionales que tienen un efecto profundo en la productividad general del aparato fotosintético, disminuyendo su producción de electrones (Fig. 1). Este mecanismo se activa dentro de los 10 s de la iluminación y da como resultado una ralentización masiva del flujo de electrones en 3 veces (Fig. 2). Este mecanismo es reversible y se puede apagar (recuperando el flujo de electrones rápido) después de una incubación anóxica oscura durante 15 min (Fig. 4).

Después de la inducción anaeróbica, las vías de flujo de electrones alternativas junto con la actividad ATPasa mejorada generan un potencial redox adicional y un suministro de ATP, se inicia la fijación de CO2 y aparece un aumento general en el flujo de electrones7,14,31. Anteriormente se demostró que la fuerza motriz de protones mejorada activa el "control fotosintético" en el que se reduce la tasa de flujo de electrones a través de Cytb6f3. Tal disminución da como resultado una reserva de PQ continuamente reducida y dificulta la actividad de PSII, generando así una presión excesiva en su lado aceptor. Esta situación sienta las bases para la hipótesis planteada por Cardona et al, al afirmar que: "Un interruptor del lado del aceptor, si existiera, podría desencadenarse, por ejemplo, por la formación de QA- antes de que QBH2 haya abandonado el sitio o la formación de QB- antes de que QH2 haya despejado el canal y permanezca en las proximidades del hemo"41.

Durante la exposición a la luz aeróbica, se demostró que la activación de la extinción no fotoquímica disminuye el rendimiento de la recolección de luz del PSII42,43,44,45, aliviando la presión causada por el exceso de luz. En este trabajo, que se centra en la anoxia, también observamos cambios en la fluorescencia de Chl a (Fig. 2c), que pueden interpretarse erróneamente como cambios en NPQ. Sin embargo, no es el componente qE dependiente de la energía de NPQ, ya que debería relajarse en menos de un minuto, ni la transición de estado lo que demostró no estar correlacionado (Figura 3 complementaria). Además, las diferencias de fluorescencia no surgen de la fotoinhibición, ya que los pulsos de saturación y las mediciones de ECS no mostraron diferencias entre las fluctuaciones de luz (consulte la Fig. 1c, d y las Figuras complementarias 4, 6). De hecho, observamos que las limitaciones del lado del aceptor se disipan en la oscuridad, en un período de tiempo inferior a 3 minutos, como lo demuestran las mediciones de ECS (Fig. 1d). Por último, los datos de TL (Fig. 4d) señalan el origen de este mecanismo de ralentización anóxica en PSII. Por tanto, podemos concluir que las limitaciones del aceptor generadas implican cambios intrínsecos en el PSII, disminuyendo su salida de electrones. Esta salida reducida se traduce en una disminución aparente en el flujo de electrones lineales, visto como una tasa reducida de producción de H2 por parte de las células.

La pregunta restante a continuación es, ¿cuál es el mecanismo detrás de esta aparente disminución de la salida de electrones del PSII? Recientemente, se demostró que la presión de excitación, causada por un grupo de PQ demasiado reducido, da como resultado una reducción excesiva de QA y QB de PSII. El aumento de la formación de QA- cambia la constante de disociación de la molécula de HCO3- y puede provocar su liberación46. Posteriormente, el sitio desocupado favorece una unión alternativa de una molécula de O247. En este punto, un semiquinol re-reducido en QA- no puede transferir el electrón hasta QB, ya que la molécula de hierro no hemo está unida al O2. Por lo tanto, es probable que esta molécula de O2 sufra reducción por QA- y libere el radical oxidativo O2•¯47,48, que luego podría convertirse en peróxido. Este proceso sin duda disminuirá la salida aparente de electrones del PSII, como se puede observar aquí (Figs. 1c, 2c y 4c). Esta observación coincide con la actividad disminuida observada de los complejos purificados en condiciones anóxicas en presencia de un exceso de quinona oxidada (DCBQ) (Fig. 3). Sin embargo, también observamos una ralentización adicional de la actividad del PSII bajo anoxia, que se produce en presencia de un exceso de bicarbonato (fig. 3). Además, se debe tener en cuenta que las observaciones in vivo (Fig. 4) muestran que apagar esta desaceleración y recuperar la velocidad original de PSII tres veces más rápida requiere una incubación mínima de 15 minutos en anoxia oscura, bastante tiempo. para una unión directa de un ligando a su objetivo. Por lo tanto, parece que aunque las modulaciones en las afinidades del hierro no hemo por el bicarbonato disminuyen la velocidad del flujo de electrones lineal aparente, también desencadenan cambios adicionales, que podrían tener un efecto prolongado.

Una hipótesis involucra un cambio de conformación, en el cual la molécula de HCO3- es reemplazada por un residuo de glutamato de PsbD (E241-D2). Recientemente, se demostró que tal estructura existe en cianobacterias inmaduras PSII49. Esto fue posible debido a la unión de otra subunidad, denominada Psb28 (que comparte algunas similitudes funcionales con la subunidad50 de PsbW de la planta), que forma un fuerte vínculo con un bucle en PsbA. Tal distorsión empuja el residuo E241-D2 hacia el hierro no hemo y estabiliza el complejo. También se postuló que tal conformación podría ayudar al proceso de ensamblaje de PSII al permitir la transferencia de electrones residuales. En este sentido, cabe señalar que la posición del E241-D2 junto al hierro no hemo es estructuralmente similar a la del E234-M del centro de reacción bacteriano anoxigénico51 (para una mayor comparación, véanse las refs. 41,52, 53). Podríamos postular entonces que tales cambios son factibles bajo anoxia y podrían estar detrás de la tasa de actividad alterada. También podría explicar por qué la relajación de los complejos para volver a su actividad óptima lleva mucho tiempo. Sin embargo, hasta la fecha, dicha conformación no ha sido detectada en complejos PSII aislados, por lo que solo podemos especular sobre su existencia y posible función.

Alternativamente, una vez que la cadena de transporte de electrones fotosintéticos se reduce en exceso y se establece un desacoplamiento entre la salida de electrones del PSII y la evolución de O254, se puede sugerir que el mecanismo de desaceleración no es una reacción inversa de carga radiativa directa, sino más bien la aparición de un flujo cíclico de electrones. en PSII presumiblemente a través de Cytb559. En consecuencia, el hemo reducido en Cytb559 reintroduce los electrones en el par de clorofila de P680, hacia el sitio QA, de una manera que depende del estado potencial del hemo55. De hecho, se postuló que Cytb559 podía oxidar el plastoquinol del sitio QB y, por lo tanto, aliviar las limitaciones del aceptor de PSII56, y las investigaciones recientes correlacionaron la disminución de la actividad de la OEC con el flujo de electrones aumentativo a través de esta vía cíclica57. Sin embargo, el mecanismo de tal ruta sigue siendo esquivo y requerirá más estudios en el futuro. En cualquier caso, la presión de electrones añadida será aliviada por un aceptor de electrones local alternativo, que posiblemente podría ser O2 en la proximidad de PSII.

En conclusión, describimos aquí un mecanismo inesperado que disminuye la salida de electrones del PSII bajo anoxia. Este proceso puede prevenir la sobreexcitación del aparato fotosintético y mitigar así el daño oxidativo. Revelar sus detalles mecánicos requerirá, por supuesto, evidencia experimental adicional y consideraciones teóricas. Sin embargo, desafortunadamente, esta disminución en el flujo aparente de electrones lineales también disminuye la producción de electrones de todo el aparato fotosintético, lo que plantea nuevas barreras a las que hacer frente en la búsqueda de fuentes de energía renovables basadas en la fotosíntesis. Tal como está ahora, este mecanismo es el techo de cristal que disminuye el rendimiento de producción de H2 fotosintético a solo un tercio de su potencial.

La cepa CC124 (137c mt-) de Chlamydomonas reinhardtii se obtuvo del Centro de recursos de Chlamydomonas. Los cultivos celulares se mantuvieron y cultivaron en matraces Erlenmeyer bajo iluminación continua (a una irradiancia de 60 μE m-2 s-1) en medio TAP (o TP para cultivos autotróficos). Se tomaron muestras de células de cultivos en fase logarítmica temprana (entre 2 y 5 mg Chl mL−1). La concentración de clorofila se determinó usando acetona al 90% según Ritchie58.

Las células se centrifugaron hasta una concentración final de 20 mg Chl mL−1 en TAP (o TP para cultivos autotróficos), HEPES 50 mM, pH 7,2 y se colocaron en una cubeta de cuarzo sellada (5 mL). Cuando se indicó, se agregaron glucosa oxidasa (200 unidades mL-1), catalasa (200 unidades mL-1) y glucosa (50 mM) para eliminar trazas de O2. La inducción anaeróbica se logró manteniendo las celdas en oscuridad durante una hora. Si se indica, se agregaron 40 µM (concentración final) de 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (DCMU, Sigma-Aldrich) y 1 mM (concentración final) de hidroxilamina (HA, Sigma-Aldrich). 10 min antes de las mediciones. En todos los experimentos que se realizaron en el JTS, se añadió un 10% de Ficoll previo a la inducción, para evitar la sedimentación celular.

Para rastrear la concentración de gases difundidos, como H2 y O2, la cubeta experimental se colocó en un espectrómetro de masas de entrada de membrana (MIMS) construido en casa, como se describe en la ref. 16. Simultáneamente, se realizaron mediciones de fluorescencia de Chl a usando un DUAL-PAM-100 (Heinz Walz Gmbh, Effeltrich, Alemania). La transición del estado de monitoreo se realizó tomando muestras de células directamente de la cubeta experimental (50 μL) e inyectándolas en un capilar de vidrio e insertándolo en un vaso Dewar (Horiba) lleno de nitrógeno líquido (a 77 °K). Luego, las muestras se midieron en un fluorímetro (Horiba Fluoromax-4), con una luz de excitación de 435 nm. La emisión se midió entre 650 y 750 nm.

Los cambios electrocrómicos (ECS) se detectaron utilizando un espectrómetro tipo Joliot (JTS-100, Biologic SAS, Francia), provisto de un BiLED, que puede medir simultáneamente la absorbancia de 520 y 546 nm, como se describe en la ref. 59. Cuando se indicó, los destellos láser fueron bombeados por un láser Nd:YAG de frecuencia duplicada (Litron nano), la longitud de onda de excitación se ajustó usando un tinte (DCM, tinte láser de excitón). Cuando las células se exponen a un único destello láser de rotación, su absorbancia cambia a través de un cambio de 3 fases27. El aumento inicial en la señal ECS (denominada "fase a") dura menos de un milisegundo y es producto de las separaciones de carga que tienen lugar en ambos fotosistemas, por lo que la disminución de la señal puede informar sobre su degradación. Durante la segunda fase (denominada "fase b"), que suele durar hasta 10 ms28, la señal de ECS aumenta debido a la acumulación de potencial de membrana, principalmente a través de Cytb6f. En la fase final (denominada "fase c"), la señal disminuye exponencialmente debido a la disipación de ruptura del potencial de membrana a través de la actividad ATPasa. Dado que no se observaron diferencias en la amplitud de la "fase a" (Figura 3 complementaria), los resultados se normalizaron. Se usaron las diferencias observadas en la cinética de la "fase b" y la "fase c" aparentes para determinar los cambios en el potencial redox a través de la membrana tilacoidal.

Las células se centrifugaron brevemente, se transfirieron a medio mínimo (TP) en una concentración final de 15 mg Chl mL−1. Los cultivos anaerobios se colocaron en frascos hipoviales de 13 ml y se lavaron con N2 durante 10 min en oscuridad, seguido de una hora adicional de incubación en oscuridad con agitación continua. Los cultivos iluminados se sometieron a 2 minutos de exposición a la luz (a una irradiación de 370 μE m-2 s-1), seguidos de 5 o 15 minutos de oscuridad antes de que se muestrearan (300 μL). Las mediciones de TL se llevaron a cabo mediante un aparato de TL hecho a medida, como se describe en la ref. 60. Para las mediciones, las muestras se colocaron en una placa de cobre al aire, conectada a un dedo frío sumergido en N2 líquido. Un serpentín calentador (SEI 10/50, Thermocoax, Francia) aseguró la temperatura deseada de la muestra durante la medición. Cabe señalar que, en el caso de células enteras, no se recomienda congelar antes de las mediciones de TL debido a un posible daño celular35, por lo que las muestras de algas se excitaron a 4 °C, mediante dos destellos de Xe saturados de recambio (de 1,5 μs de duración a la mitad). intensidad máxima, con un retraso de 1 s entre destellos). Después de esto, la muestra se calentó a 70 °C en la oscuridad con una velocidad de calentamiento de 20 °C min-1. La TL emitida se midió con un fotomultiplicador (H10721-20, Hamamatsu, Japón) simultáneamente con el registro de la temperatura.

Se cultivaron células de Chlamydomonas reinhardtii en 10 L de medio TAP. Las células se cultivaron con agitación constante y burbujeo de aire bajo luz blanca continua (35–40 µE m−² s−¹) a 18 °C hasta que la OD730 final alcanzó 0,5–0,7. Luego, se verificó el desprendimiento de O2 del cultivo, se cosechó por centrifugación a 3500 × g durante 5 min y se resuspendió en un medio que contenía HEPES 25 mM pH 7,5, sacarosa 300 mM y MgCl2 5 mM. Las células se lavaron una vez en el mismo tampón, se centrifugaron a 5000 × g durante 5 min y se resuspendieron en un tampón principal que contenía MES-NaOH 25 mM, pH 6,5, MgCl2 1 mM, NaCl 10 mM, betaína 1 M, sacarosa 200 mM, y 10% del glicerol. Se añadió cóctel de inhibidores de proteasa a concentraciones finales de PMSF 1 mM, pepstatina 1 μM, bestatina 60 μM y benzamidina 1 mM. Las células se rompieron con un Avestin EmulsiFlex-C3 a 2000 psi (dos ciclos). Las células intactas y los gránulos de almidón se eliminaron mediante centrifugación a 12 000 × g durante 5 min y las membranas del sobrenadante se precipitaron mediante centrifugación en un rotor Ti70 a 273 300 × g durante 40 min. El precipitado se resuspendió en el mismo tampón de ruptura dando una concentración de clorofila de 2 mg Chl mL−1. Se agregaron gota a gota n-decil-α-D-maltopiranósido (α-DM) y n-octil β-D-glucopiranósido hasta una concentración final de 2,5 % cada uno y una concentración final de clorofila de 1 mg Chl mL−1. Después de agitar a 4 °C durante 30 min, el material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 12 000 × g durante 10 min. El sobrenadante se cargó en gradientes de sacarosa en el rotor SW-60 (≈900 μg de clorofila por tubo), composición del gradiente 15-40 % de sacarosa, MES-NaOH 25 mM, pH 6,0, betaína 0,5 M, glicerol al 10 %, α-alfa al 0,2 % DM y ejecutar a 310.000 × g durante 14-16 h. Las dos bandas inferiores se recogieron y midieron directamente (la congelación no es posible ya que la calidad de la muestra se deteriora rápidamente) como se describe a continuación.

Para la determinación de la evolución de O2, se reconstituyó PSII purificado a una concentración final de 10 µg chl mL−1 en MES-NaOH 25 mM, pH 6,5, MgCl2 2,5 mM, CaCl2 2,5 mM, betaína 1 M, glicerol al 12,5 %, NaHCO3 10 mM, α-DM al 0,05 % suplementado con 2,6-dicloro-1,4-benzoquinona (DCBQ) 350 µM recién preparada hasta un volumen final de 1 ml y colocado en un vial de vidrio termorregulado ALGi, tapado con un tapón de silicona. La concentración de O2 se obtuvo utilizando un sensor óptico de O2 (Pyroscience FireSting, sonda OXROB3). La mezcla de reacción se expuso a: 5, 10, 20 o 30 s de iluminación (370 µE m−² s−¹, luz LED blanca) con un minuto de oscuridad entre exposiciones. Para establecer las condiciones anaeróbicas, se inyectó una corriente constante de gas N2 en el espacio de cabeza del vial a través de una aguja de entrada. Los niveles de O2 se monitorearon durante unos minutos, hasta que la concentración de O2 se redujo a 10 μM. Después de lo cual, se expulsó la aguja y se inició el experimento como se describe anteriormente.

Para generar replicaciones biológicas, se inocularon cultivos celulares de colonias individuales antes de cada experimento. Dado que las Figs. 1, 2 y 4 paneles a–c describen un fenómeno cinético, los resultados se presentan en sus trazos originales, de los resultados promediados, para mejorar la visibilidad y claridad de la figura. Las repeticiones mostraron la misma proporción de cambio que se describe y presenta en el texto. Los complejos de PSII purificados se recolectaron de tilacoides aislados antes de cada experimento para evitar el deterioro de la actividad. Las repeticiones individuales y su resultado promedio se presentan en el archivo de material complementario adjunto (Datos complementarios 1). Las diferencias significativas en todas las Figuras entre las exposiciones de luz iniciales y sucesivas se calcularon utilizando una prueba t de Student, en Microsoft Excel, así como los diagramas de caja presentados en las Figs. 3 y 4d.

Todos los datos se muestran en este MS, los archivos de Excel de los datos sin procesar están disponibles como material complementario (Datos complementarios 1). En caso de cualquier solicitud adicional, se pueden compartir datos adicionales con cualquier persona interesada.

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Agradecemos a M. Hippler y F. Buchert de WWU Münster, Alemania por el debate constructivo. Agradecemos a N. Shahar de TAU, Israel por leer detenidamente el manuscrito y por sus comentarios ya László Kovács (BRC Szeged) por su ayuda con las mediciones de TL. Este trabajo fue apoyado por el Programa Lendület/Momentum de la Academia Húngara de Ciencias (beca de investigación LP2014/19 para SZT) y las becas de investigación de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (K132600 y FK 135633) para SZT y VN), y por la Fundación de Ciencias de Israel (subvención número 941/22 a IY).

Escuela de Ciencias Vegetales y Seguridad Alimentaria, Facultad de Ciencias de la Vida George S. Wise, Universidad de Tel Aviv, Ramat Aviv, Tel Aviv, 69978, Israel

Yuval Milrad, Tamar Elman & Iftach Yacoby

Instituto de Biología Vegetal, Centro de Investigación Biológica, Szeged, Timisoara krt. 62, H-6726 Szeged, Hungría

Valéria Nagy y Szilvia Z. Tóth

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Vida George S. Wise, Universidad de Tel Aviv, Ramat Aviv, Tel Aviv, 69978, Israel

María Fadeeva

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investigación diseñada por YM, SZT e IY; YM, TE, VN e IY realizaron investigaciones; MF proporcionó PSII purificado; YM, SZT e IY analizaron los datos; YM, SZT e IY escribieron el artículo.

Correspondencia a Iftach Yacoby.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Faisal Koua, Bill Rutherford y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: David Favero. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Milrad, Y., Nagy, V., Elman, T. et al. Se activa un control fotosintético PSII en cultivos anóxicos de algas verdes después de la iluminación. Comun Biol 6, 514 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04890-3

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Recibido: 08 Septiembre 2022

Aceptado: 01 mayo 2023

Publicado: 12 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04890-3

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